La microscopie de fluorescence est un outil incontournable dans la recherche biomédicale. Les nouvelles techniques d’imagerie en combinaison avec de puissants logiciels d’analyses, ont permis aux scientifiques d’avancer au-delà des limites de la résolution optique.

La Plateforme d'Imagerie Cellulaire de la Structure Fédérative de Recherche Necker Enfants Malades est spécialisée dans la visualisation et l'analyse de la structure et de processus dynamiques au niveau cellulaire et tissulaire jusqu’à l’échelle de l’organisme. Elle a pour mission de mettre à disposition des biologistes et des médecins (internes ou externes à l'Institut) des instruments d'optique et des outils d’analyses de pointe accompagnés d'une expertise.

 

Nouveauté sur la plateforme :

Thanks to Imagine Institut financing, the Cell Imaging platform has just acquired a new confocal microscope equipped with STED technology ( Stimulated Emission Depletion) : a Leica TCS STED SP8 -3X with STED 660nm Laser confocal microscope .

The STED is a super- resolution method based on fluorescence confocal  imaging , in which images are acquired by scanning a focused light spot over a region of interest and  collecting  the fluorescence sequentially pixel by pixel. The main strengths of this technology are :
1 . Lateral resolution without any additional post- processing below 50 nm due to the vortex " donut "
2 . Intrinsic confocal optical sectioning , allowing the acquisition of three-dimensional structures
3 . Fast image acquisition of several images per second
4 . Live- imaging capabilities by using either fluorescent proteins or other fluorescent tags.

  • Nicolas Goudin  01 72 60 63 39 
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  • Microscopie photonique classique

    Plein champs

    La microscopie plein champ permet l'acquisition d'images et de films par une caméra CCD, d'échantillons vivants ou fixés. Ces échantillons peuvent être entiers de petites tailles (cellules, bactéries, levures, ...) ou des coupes de tissus. Les acquisitions peuvent être réalisées dans les 3 dimensions de l'espace (X, Y et Z), au cours du temps, en mode lumière blanche ou fluorescence multicouleurs.

    Equipements disponibles :

    • Microscope droit ZEISS AXIOPLAN 2  (Site Necker)
    • Caméra : QCam Ropper avec un mode RGB (lumière blanche) et un mode MONO (fluorescence)
    • Filtres : DAPI / GFP / RHOD
    • Objectifs : 5x/0.12 A-Plan, 10x/0.3 Plan Neofluar, 25x/0.8 Plan Neofluar,  63x/1.4 Plan Apochromat
    • Vidéomicroscope NIKON (Site Necker)
    • Chambre thermostatée, régulée en CO2 et humidité
    • Platine motorisée, super Z galvo,
    • 2 caméras : Coolsnap HQ2 / Quantem 512
    • Source d’excitation : DG4
    • Objectifs : 10x/0.3 Plan Fluor, 20x/0.5 Plan Fluor, 40x/1.3 Plan Fluor, 60x/1.4 Plan Apo, 100x/1.49 Apo TIRF
    • Statif inversé Nikon Eclipse Ti
    • Microscope à illumination structurée ZEISS ApoTome2 (Site Broussais)
    • Statif inversé Observer Z1
    • Objectifs : 10x/0.5 Fluar, 20x/0.75 Plan Apo, 40x/1.3 DIC Plan Apo, 63x/1.4 DIC Plan Apo
    • Platine motorisée

     

    Confocal à balayage laser

    Un microscope confocal est un microscope optique qui a la propriété de réaliser des images de très faible profondeur de champ (environ 400 nm) appelées « sections optiques ». En positionnant le plan focal de l’objectif à différents niveaux de profondeur dans l’échantillon, il est possible de réaliser des séries d’images à partir desquelles on peut obtenir une représentation tridimensionnelle de l’objet. L'objet n'est donc pas directement observé par l'utilisateur ; celui-ci voit une image recomposée par ordinateur.

    Le microscope confocal fonctionne en lumière réfléchie ou en fluorescence. La plupart du temps, on utilise un laser comme source de lumière. On parle alors de microscope confocal à balayage laser — MCBL (en anglais CLSM pour confocal laser scanning microscope).

    Equipements disponibles :

    • Microscope confocal ZEISS LSM700 (Site Necker)
    • Statif inversé Observer Z1 :
    • 4 lasers (405nm, 488nm, 555nm, 639nm), 2 PMTs + 1 PMT Trans
    • Objectifs : 10x/0.5 Fluar, 20x/0.75 Plan Apo, 40x/1.3 DIC Plan Apo, 63x/1.4 DIC Plan Apo
    • Platine motorisée
    • Microscope confocal LEICA SP5 (Site Broussais)
    • Statif inversé DMI 6000
    • 4 lasers (405nm, Argon, 561nm, HeNe 633nm), 3 PMTs + 1 PMT Trans
    • Objectifs : 10x/0.3 Plan Fluotar, 20x/0.70 PL APO, 40x/1.25 DIC PL APO, 63x/1.4 DIC λ blue PL APO
    • Platine motorisée,
    • Chambre thermostatée+CO2
    • Microscope confocal LEICA SP8 (Site Necker)
    • Statif inversé DMI 6000
    • 4 lasers (405nm, Argon, 561nm, HeNe 633nm), 3 PMTs + 1 PMT Trans
    • Objectifs : 20x/0.70 CS PL APO, 40x/1.30 Oil CS2 PL APO, 63x/1.20 W CORR CS2 PL APO
    • Scanner Tandem résonnant 8 kHz
    • Platine motorisée, surper Z galvo, chambre thermostatée

     

    Microscopie photonique avancée

    TIRF (Total Internal Reflexion Microscopy)

    Le microscope de fluorescence par réflexion totale interne (TIRF, total internal reflection fluorescence microscopy), ou microscope à onde évanescente, est un type particulier de microscope optique à fluorescence permettant d'examiner une tranche très fine d'un échantillon (moins de 200 nm d'épaisseur), grâce à un mode d'illumination particulier : la réflexion totale interne. Le principe est de n'exciter la fluorescence que sur une très faible profondeur, immédiatement adjacente à l'interface verre (support de l'échantillon)/eau (milieu environnant l'échantillon). L'excitation est due à une onde évanescente. Celle-ci est générée uniquement quand la lumière incidente est totalement réfléchie à l'interface verre / eau, ce qui ne se produit que pour un certain angle d'incidence : l'angle critique, c'est la réflexion totale interne. On peut ainsi en TIRFM visualiser de manière très sélective les régions de contact de la cellule avec son support et étudier avec une très grande résolution la morphologie ou les évènements intervenant à la membrane plasmique des cellules vivantes ou fixées.

    Equipement disponible : Vidéomicroscope/TIRF NIKON (Site Necker)

    • Statif inversé Nikon Eclipse Ti
    • Objectifs : 100x/1.49 Apo TIRF
    • Lasers d’excitation : 488nm et 561nm
    • Caméra : Quantem 512
    • Platine motorisée, surper Z galvo,
    • Chambre thermostatée, régulée en CO2 et humidité

    Exemple :

    Microscopie Epifluorescence      Microscopie TIRF
       

          

    Microscopie biphotonique

    L’excitation biphotonique consiste en l'absorption quasi-simultanée de deux photons d'excitation d'une longueur d'onde proche de deux fois l'excitation optimale à un photon. On utilise pour cela un laser pulsé dans des fréquences proches de l'infrarouge. Dans ce cas, seul le point de focalisation du faisceau laser est excitateur (densité de photon suffisante pour coupler l'énergie d'excitation).

    Ce système est considéré comme une évolution technologique importante pour trois raisons majeures :

    1. Il n'existe pas d'iris confocal (sténopé) dans un microscope biphotonique.
    2. L'utilisation d'une lumière d'excitation à une longueur d'onde élevée (> 900 nm) assure une plus grande pénétration à l'intérieur de l'échantillon (jusqu'à 500 µm au lieu de 150 µm) offrant la possibilité de travailler sur des échantillons plus épais.
    3. L'excitation des fluorophores étant limitée au point de focalisation du faisceau laser, le risque de photoblanchiement est réduit.

    En pratique, le rendement d'émission de fluorescence est moins bon qu'un confocal simple photon et le rapport signal/bruit est plus faible. Ainsi, il ne montre que peu d'avantage pour l'observation de cellules en culture ou de coupes de tissu (50-70 µm d'épaisseur).

    Equipement disponible : Multiphoton Lavion Biotec (Site Necker)

    • Statif inversé OlympusStatif Olympus
    • Objectifs : x 20 W/0,95
    • Laser pulsé Spectraphysics MaiTai HP (690 à 1020 nm)
    • 4 PMTs de détection avec les filtres BP suivant :  BP 400-480nm, BP 510-545nm, BP 575-630nm, BP 660-700nm
    • Platine motorisée
    • Chambre thermostatée

     

    FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) et FCS (Fluorescence Correlation Spectroscopy)

    Under Construction- Under Construction- Under Construction.

     

     

     

     

    Traitements et analyses d’images

    Les logiciels disponibles tant sur Necker que sur Broussais sont :

    • ImageJ et Fiji : logiciels libres de traitement et d'analyse d'images 3-4-5 D disposant de nombreux plugins et permettant la création de scripts (macros) personnalisés.
    • Imaris (Bitplane) : logiciel de reconstruction et de représentation des images 3-4-5 D, et de quantification et de manipulation d'images ; il est interfacé avec Fiji et Matlab.
    • Metamorph : logiciel de manipulation d'images permettant l'ouverture des images avec la même interface que les logiciels d'acquisition Metamorph ; il permet également d'analyser les images
    • Zen (Zeiss) : logiciel de manipulation d'images permettant l'ouverture des images avec la même interface que les logiciels d'acquisition des microscopes Zeiss ; il permet également d'analyser les images.
    • LAS AF (Leica) : logiciel de manipulation d'images permettant l'ouverture des images avec la même interface que les logiciels d'acquisition des microscopes Leica ; il permet également d'analyser les images.
    • NIS Elements : logiciel de manipulation d'images permettant l'ouverture des images avec la même interface que les logiciels d'acquisition des microscopes Nikon ; il permet également d'analyser les images

     

    En raison du déménagement d’un certain nombre d’équipes de recherche de la SFR sur l’hôpital Broussais, la plateforme d’imagerie cellulaire est constituée de deux annexes :

    • l’une localisée au 96 Rue Didot, Pavillon Leriche, Porte 9, 75014 Paris
    • l’autre à l’hôpital Necker Enfants Malades, Bâtiment Imagine, RDC bas porte S9, 24 boulevard du Montparnasse, 75015 Paris

    Pour nous contacter :

    Plateforme d'Imagerie Cellulaire de la SFR Necker UMS 24
    Hôpital Necker Enfants Malades
    Bâtiment Imagine
    RDC bas porte S9
    24 boulevard du Montparnasse 75015 Paris

    Tél : 01 42 75 42 67

    Les missions de la plateforme sont :

    • Aider les utilisateurs à la conception des outils (biologie moléculaire, étiquetage des protéines, choix des marquages et des fluorophores) et à la mise en place de l'expérience (définition des contrôles, des modes opératoires, des précautions à prendre vis-à-vis des artefacts potentiels)
    • Orienter les utilisateurs vers les systèmes d'imagerie les plus adaptés à leur problématique
    • Encadrer les utilisateurs pour la réalisation de leurs expériences et les amener progressivement vers l'autonomie
    • Encadrer les utilisateurs pour le traitement et l'analyse de leurs données
    • Aider les utilisateurs dans l'interprétation et la présentation des résultats

    Le personnel de la plateforme se charge également :

    • du développement de méthodes d'imagerie et d’analyses d’images
    • de la maintenance technique et de la métrologie des systèmes afin de veiller à leur bon fonctionnement quotidien.
    • de la veille technologique au gré des évolutions de la microscopie photonique

    La prise de contact se fait exclusivement par mail à . Suite à cela, nous fixerons un rendez-vous pour discuter du projet afin de vous orienter vers l’équipement le plus adapté.


    Les expériences longues en overnight, les samedis et dimanches seules 50% des heures effectuées sont facturées.

     

    Métrologie:

    La métrologie consiste à réaliser un certain nombre de mesures en valeurs absolues avec des étalons de mesures stables selon un protocole préalablement défini, afin d’évaluer le fonctionnement d’un système dans le temps et d’en garantir son bon fonctionnement.

    La métrologie est effectuée sur chaque système de la plate-forme au moins deux fois par an.

     

    Les demandes de financement nécessaires au développement de la plateforme rendent indispensables que l’activité de la plateforme soit explicitement reconnue.
    Cette reconnaissance peut se traduire dans les articles, par la mention « image acquisition and image analysis were performed on the Necker Institute Imaging Facility » dans la rubrique Materials and Methods. Et « the authors greatly acknowledge ___________of the Necker Institute Imaging Facility » dans les remerciements.

    Lorsque la participation d’un membre de la plateforme a été décisive dans la conduite du projet, les utilisateurs le font figurer dans la liste des signataires de l’article.

    D’autre part, lorsque vous utilisez du matériel financé par une fondation, association…, cette dernière devra également être remerciée (Fondation Imagine, ARC, FRM).

     

    Liste des publications de la plateforme

    Abed J et al. Abnormal apical-to-basal transport of dietary ovalbumin by secretory IgA stimulates a mucosal Th1 response. Mucosal Immunol. 2013 Jul.

    Philippe et al. Dlg1 scaffolding protein participates with AP-1 and clathrin in forming Weibel-Palade bodies of endothelial cells. J Biol Chem. 2013 May.

    Khen-Dunlop N et al. Prenatal intestinal obstruction affects the myenteric plexus and causes functional bowel impairment in fetal rat experimental model of intestinal atresia. PLoS One, 2013 May.

    Lebreton C et al. Interactions among secretory immunoglobulin A, CD71, and transglutaminase-2 affect permeability of intestinal epithelial cells to gliadin peptides. Gastroenterology, 2012 Sept.

    Kurowska M et al. Terminal transport of lytic granules to the immune synapse is mediated by the kinesin-1/Slp3/Rab27a complex. Blood. 2012 Apr.

    Putoux A et al.KIF7 mutations cause fetal hydrolethalus and acrocallosal syndromes. Nat Genet. 2011 Jun.

    Auffray C. et al. Patrolling blood monocytes that monitor blood vessels and tissues for damage and infection. Science 2007 Aug.

    Patey-Mariaud de Serre N. et al. Collagen alpha5 and alpha2(IV) chain coexpression: Analysis of skin biopsies of Alport patients. Kidney Int. 2007 August.

    Menager MM et al. Secretory cytotoxic granule maturation and exocytosis require the effector protein hMunc13-4. Nat Immunol. 2007 Mar.