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Service Commun de Tri Cellulaire

Le plateau technique de cytométrie de l’IFR94 mutualise, pour les unités de recherche du site Necker –Enfants Malades, deux cytomètres trieurs et un cytomètre analyseur.
Le trieur de la Fondation IMAGINE est mis à la disposition des utilisateurs du Service Commun de Tri Cellulaire de l’IFR94, dans le cadre de créneaux horaires prédéfinis.

Présentation des deux cytomètres trieurs :

BD FACSVantage SE Diva (Becton-Dickinson), dédié aux tris cellulaires murins ne contenant pas d’OGM.
3 sources d’excitation  :
- Laser Argon 488nm + U.V. simultané
- Laser Hélium-Néon 633nm
Tris cellulaires avec 1, 2, 3 , 4 ou 5 fluorochromes
Equipé de l’automate de dépôt : cette option réalise le tri et le dépôt d’un nombre prédéfini de cellules sur des lames de microscope, des plaques multi-puits de culture cellulaire ou des barrettes de micro-tubes pour PCR
Option « Turbo-Sort » permettant d’effectuer des tris à la vitesse de 10 000 cellules/seconde
Software : Diva

BD FACSAria (Becton-Dickinson), dédié aux tris de cellules humaines ne contenant pas d’agents pathogènes pour l’homme, de cellules génétiquement modifiées par des vecteurs viraux dont la perte de la pathogénicité est sûrement établie.
3 sources d’excitation :
- Laser Solid state 488nm
- Laser Hélium-Néon 632nm
- Laser Solid state 407nm
Tris cellulaires avec 1 à 10 fluorochromes
Equipé de l’automate de dépôt : cette option réalise le tri et le dépôt d’un nombre prédéfini de cellules sur des lames de microscope, des plaques multi-puits de culture cellulaire ou des barrettes de micro-tubes pour PCR
Vitesse de tri : 20 000 cellules/seconde
Software : Diva

Présentation du cytométre trieur de la Fondation IMAGINE :

BD FACSAria SORP (Becton-Dickinson), dédié aux tris de cellules murines et humaines ne contenant pas d’agents pathogènes pour l’homme, de cellules génétiquement modifiées par des vecteurs viraux dont la perte de la pathogénicité est sûrement établie.
4 sources d’excitation :
- Laser Solid state 488nm
- Laser Hélium-Néon 632nm
- Laser Solid state 407nm
- Laser UV à 355 nm
Tris cellulaires avec 1 à 13 fluorochromes
Equipé de l’automate de dépôt : cette option réalise le tri et le dépôt d’un nombre prédéfini de cellules sur des lames de microscope, des plaques multi-puits de culture cellulaire ou des barrettes de micro-tubes pour PCR
Vitesse de tri : 20 000 cellules/seconde
Software : Diva

Présentation du cytomètre analyseur :

BD LSRI (Becton-Dickinson),
3 sources d’excitation : 
- Laser Solid state 488nm
- Laser Hélium-Néon 632nm
- Laser U.V. 325nm
Détection : 1 à 6 fluorochromes
Software : Cellquest

Le BD LSR I sera remplacé courant septembre 2009 par le BD LSR Fortessa (Becton-Dickinson), plus performant, dont voici les principales caractéristiques techniques :

4 sources d’excitation :
Laser Coherent Sapphire 488 nm
Laser Coherent Cube 639 nm
Laser Coherent Cube 405 nm
Laser Coherent Compass 561 nm
Détection : 17 paramètres de fluorescence peuvent être mesurés simultanément
Software : BD FACSDiva

REMARQUE 1 :

La configuration optique du Fortessa est différente de la majorité des appareils, trieurs ou analyseurs du site Necker, BD FACS Aria ou BD FACS Canto.

L’innovation essentielle est la présence d’une source d’excitation supplémentaire à 561 nm.
Ce laser permet la détection des protéines fluorescentes rouges telles que Tomato, Cherry . (Il sera intéressant de tester la faisabilité avec les protéines RFP et DsRed, en fonction des types cellulaires).
Il permet également d’exciter le fluorochrome PE ainsi que ses dérivés tandem.
Le bloc optique de collecte des signaux émis par le laser à 561 nm est un BD Octagon^TM équipé de 6 détecteurs pour la mesure de 6 fluorescences (par exemple : PE ou DsRed, PE-Texas-Red ou Cherry ou Tomato, PE-Cy5, PE-Cy5.5, PE-Cy7).

Une autre grande nouveauté est la présence d’un BD Octagon^TM pour la collecte des signaux émis par le laser violet à 405 nm. Il est équipé de 6 détecteurs pour la mesure de 6 fluorochromes parmi Horizon V45O ou Pacific Blue, AmCyan ou Alexa Fluor 430, Qdot 565, 585, 605, 655, 700, 705, 800.

REMARQUE 2 :

Le bloc optique de collecte des signaux émis par le laser à 488 nm est un BD Trigon^TM équipé de 3 détecteurs pour la mesure de 3 fluorescences dont SSC, FITC et PerCp, par exemple.
Le bloc optique de collecte des signaux émis par le laser à 639 nm est un BD Trigon^TM équipé de 3 détecteurs pour la mesure de 3 fluorescences (par exemple : APC ou Alexa Fluor647, Alexa Fluor700, APC-Cy7 ou APC-H7).

Ces listes de fluorochromes sont données à titre indicatif, elles ne sont pas exhaustives . Sont absents les marqueurs de viabilité cellulaire, des fonctions cellulaires et du métabolisme ainsi que d’autres fluorochromes tels que les Alexa Fluor .
Nous pourrons vous donner plus de précision lorsque l’appareil sera installé, en particulier les combinaisons optimales de fluorochromes à utiliser.

REMARQUE 3 :

Une présentation générale de l’appareil sur site, sera annoncée, fin septembre, via le réseau intranet.

Les nouveaux utilisateurs bénéficieront d’une formation individuelle, et surtout, n’oubliez pas que le personnel du service est présent pour vous accompagner et vous assister dans la mise au point de protocoles expérimentaux.

 

Applications :

Caractérisation et isolement des populations cellulaires selon les techniques suivantes :

1. phénotypage, multi-marquages membranaires et intracellulaires
2. analyse des cellules transfectées avec des systèmes rapporteurs fluorescents (GFP et variants)
3. analyse des cellules souches hématopoïétiques « Side Population » (Hoechst 33342)
4. étude du cycle cellulaire (Cellules perméabilisées : IP, Cellules intactes : Hoechst33342 Incorporation de nucleosides : BrdU)
5. étude des paramètres vitaux de la cellule : prolifération cellulaire (CFSE), potentiel membranaire mitochondrial (JC-1, DiOC2, MitoTracker), activité enzymatique, intégrité membranaire (IP, colorants Sytox,7-AAD)
6. étude du flux calcique (Indo-1)

Le service peut développer de nouvelles applications, à la demande, en fonction du potentiel technologique de nos équipements, et de leur évolution possible.

Prestations de services :

1. Réalisation de tris cellulaires sur les 2 trieurs du service et le trieur de la Fondation IMAGINE
2. Formation théorique et pratique : enseignement des principes de la cytométrie, formation à l’utilisation des cytomètres trieurs et analyseurs et des outils informatiques d’analyse (CellQuest et DivaSoftware)
3. Accompagnement et assistance technique dans la mise au point de protocoles expérimentaux sur cytomètres trieur et analyseur
4. Aide à l’interprétation des résultats

 

Locaux , Personnels et coordonnées :
Nous sommes situés au 1er sous-sol de la faculté de médecine Paris Descartes-site Necker, pièce n°15 (BD FACSAria) , pièce n°17 (BD FACSVantage SE Diva) et pièce n°19bis (BD LSRI).

Responsable scientifique :
Claude-Agnès Reynaud (Directeur U783)
claude-agnes.reynau@inserm.fr
Responsable technique : Corinne Cordier
corinne.cordier@inserm.fr
Assistant : Jérome Mégret
jerome.megret@inserm.fr

Téléphone : 01 40 61 56 86

Fonctionnement du service :
Les trieurs sont pilotés par Corinne et Jérome, il faut prendre RDV avec nous pour effectuer un tri cellulaire .
Les trieurs BD FACSAria et BD FACSAria SORP (Fondation IMAGINE) sont mis à la disposition des utilisateurs autonomes, à des créneaux horaires précis. L‘organisation et la gestion des créneaux des utilisateurs autonomes sont effectuées par Corinne et Jérome.
L’analyse est interdite sur le BD FACSAria SORP.
Pour utiliser l’analyseur, veuillez consulter son agenda de réservation, pièce n°19bis.

 

Commentaire du responsable scientifique :
Si l’activité de tri cellulaire constitue un service mis à la disposition des unités de recherche de l’IFR, il est raisonnable d’envisager l’intervention de Corinne ou de Jérome comme une participation scientifique dès que la technicité de leur intervention prend une part importante dans un travail scientifique, et donc de les inclure dans les publications dans lesquelles la contribution du tri cellulaire dépasse la simple routine.